李 娟　 王佑春     　宫颈癌是严重危害妇女健康和生命的疾病，每年约有50万新发病例，25万人死亡，是引起妇女死亡的第二大原因，其中大部分在发展中国家，占80%左右 ［1］  。1977年德国学者Zur Hausen等从宫颈癌标本中发现了人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）DNA，推测HPV感染与宫颈癌发生有关。进一步的分子流行病学证据表明，HPV与人类多种癌症，特别是与宫颈癌有着密切的关系。由国际癌症研究机构（IARC）组织在22个国家进行了针对引起侵袭性宫颈癌（ICC）的HPV类型的调查 ［2］  。组织学确诊为ICC的1000个病例中有99.7%发现HPV DNA阳性，其上HPV的类型主要为HPV16（53%）和HPV18（15%）。　　1 机体对HPV感染的免疫反应    HPV属乳头多瘤空泡病毒科（Papovaviridae）乳头瘤病毒属，是一类感染表皮和粘膜鳞状上皮的小DNA病毒。其基因组为双链环状DNA，长7.5～8.0kb，含8个开放阅读框（open reading frames，ORFs），依功能不同分3个区:（1）早期区（early region，E区）:分别编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等六个早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能。（2）晚期区（late region，L区）:编码主要外壳蛋白L1和次要外壳蛋白L2。（3）非编码区（uncoding region，UCR）或上游调控区（URR）:含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。    按照HPV感染与宫颈癌发生的危险性，将HPV分为低危型（HPV1，6，11等）和高危型（HPV16，18，31，45等）。低危型HPV主要引起表皮细胞良性增生，如HPV6和11型可引起生殖器疣和儿童复发性乳头瘤。高危型HPV与宫颈上皮内瘤的发生和恶变以及其他上皮性肿瘤的发生相关。HPV感染在人群中较为普通，大部分人在性生活开始后，都感染过该病毒。病毒通过受损的上皮组织进入基底层细胞，其复制周期受严格的调节，并依赖于病毒编码的蛋白质和宿主上皮细胞的分化程度。病毒感染通常为局部限制性，不引起炎症反应。大多数人都能自行清除病毒，只有一小部分人由于免疫系统的原因无法清除病毒，造成HPV持续存在，继而发展为宫颈癌。    许多证据表明HPV感染能激发宿主免疫反应，如大多数皮肤疣两年内可自发消退，且多处感染灶同时消退 ［3］  。大多数人在性生活开始后，都感染过HPV，随后感染率降低，说明免疫系统可以清除病毒并长期产生保护作用。HPV中和抗体可以保护机体免受病毒的感染，但对已经存在的病毒，则需要细胞免疫来清除已感染的细胞。在宫颈损伤病人的消退过程中大多可检测到细胞免疫反应的升高 ［4］  ;而免疫抑制如器官移植时，病人患疣的机率增大;HIV病人比健康人患尖锐湿疣的机率高2～7倍;由此可见，细胞介导的免疫机制对于控制HPV感染有重要的作用。    2 HPV疫苗研究现状      　　由于从感染灶组织中很难分离到病毒体，迄今未能建立体外培养系统进行病毒培养。目前对宫颈癌的治疗基本以手术和放疗为主，给病人带来很大的痛苦。预防HPV相关癌症的最有效的方法是研制特异性的疫苗，诱导机体产生中和抗体，激发保护性免疫反应，达到有效预防与癌症相关型的HPV传播的目的，降低宫颈癌的发生率，并且可能降低与HPV感染弱相关的癌症如肛门、外阴或扁桃体癌的发生率。由于E6、E7蛋白具有转化活性，使用全病毒做疫苗有致癌的危险，因此，目前的研制方向主要集中在亚单位疫苗方面。根据其功能不同，疫苗分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗多以HPV的主要衣壳蛋白L1体外表达形成的病毒样颗粒（VLPs）为靶抗原，诱导机体产生特异性的中和抗体。治疗性疫苗则以HPV早期蛋白如改造过的E6、E7蛋白作为靶抗原，诱导产生特异性的细胞免疫反应，用于CIN和宫颈癌的免疫治疗。近年来研究的如嵌合型病毒样颗粒疫苗、HPV假病毒疫苗等同时具有预防和治疗双重功能。    2.1 病毒样颗粒（VLPs） HPV有两种衣壳蛋白，主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。在天然HPV病毒颗粒形成过程中，衣壳蛋白包装病毒DNA形成成熟的病毒颗粒。研究表明，在许多表达体系如哺乳动物细胞、酵母和细菌 ［5，6］  中，单独L1或L1和L2共表达后可自行组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒（VLPs），这种VLPs结构与天然的病毒颗粒相似，用来免疫动物诱导产生高滴度的中和抗体，证明在VLP表面存在中和抗体的表位 ［7］  。由于L1抗体识别构象依赖的型特异表位，因此，保持一定的空间构象对VLP的免疫原性非常重要。当其变性后便失去诱导产生中和抗体的能力。HPV VLPs还能通过MHC I途径诱导产生细胞免疫。HPV16型L1装配成的VLPs经鼻免疫小鼠后，可在脾及阴道淋巴组织中发生淋巴细胞增殖。以产生IFN-γ的CD4 + T细胞增为主，髂骨淋巴细胞中增生的T淋巴细胞具有CTL活性，说明VLPs可诱导MHCI类限制性CD8 + 反应 ［8］  。    动物实验证明VLP诱导产生的抗体对动物的保护率几乎达到100%，说明体液免疫足够保护机体免受病毒的感染。对VLP疫苗进行的一些临床试验也证明了其安全有效性。在健康人群中进行的随机、双盲实验对HPV16L1VLP的安全性和免疫原性进行了评价。结果表明所有的疫苗均有极好的耐受性，受试者均发生血清阳转，在没有佐剂的情况下也有很好的免疫原性 ［9］  。HPV11L1VLP在健康志愿者中进行的Ⅰ期临床试验得到相似的结果。由Merck，GlaxoSmithKline和NIH生产的VLPs疫苗和不同的早期蛋白与L1/L2蛋白组成嵌和病毒样颗粒cVLP正在进行Ⅲ期临床试验 ［10］  。Ⅰ和Ⅱ期临床实验证明HPV VLPs疫苗是安全的，并有高度的免疫原性，VLPs免疫后诱导产生的中和抗体效价是自然感染的100倍。1998年10月～1999年11月，在美国女性中进行了HPV16L1VLP临床试验。酵母表达的VLP纯化后吸附于铝佐剂，免疫组抗体效价远远高于对照组。免疫后17.4个月跟踪调查显示，对照组HPV16持续感染率为3.8%，免疫组为0。所有9例HPV16相关的宫颈上皮内瘤均发生在对照组 ［11］  。该实验结果充分说明了VLP是最有前途的疫苗之一。    高危型HPV的早期蛋白E6、E7持续表达于HPV感染的肿瘤细胞上，因此，可作为诱导肿瘤特异性CTL反应的最佳靶抗原。Muller等 ［12］  用HPV16E7蛋白部分序列代替L1蛋白C端34的氨基酸，构建了cVLP。实验证明C端插入60个氨基酸不影响VLP的形成，免疫动物后诱导产生中和抗体。因此，利用这一特点，C端还可以插入其它HPV特异序列或非HPV特异序列，如已知的肿瘤抗原的T细胞表位。各种研究证明不同HPV诱导的中和抗体的保护作用具有型特异性。使用ELISA和交叉中和实验对九种HPV（6，11，16，18，31，33，35，39，45）亚型进行了免疫活性分析，HPV衣壳蛋白具有高度的免疫原性和型特异性，但不同类型之间的交叉中和活性很低 ［13］  。体外感染实验表明只有同型的VLP抗血清才能中和假病毒颗粒。因此，许多疫苗采用多型混合免疫的策略，如包括16，18，31和45的VLPs能够预防75%的宫颈癌 ［1］  。在预防性疫苗VLPs中至少还应该包括一种非癌基因型HPV，如HPV6主要引起生殖疣，针对它的抗体与HPV11有交叉中和活性，而HPV11是引起生殖疣的第二大原因。包括低危型HPV的多价疫苗有可能解决生殖疣高频率发生的问题和治疗上的困难。    2.2 DNA疫苗 DNA疫苗是将编码外源蛋白基因的质粒DNA直接导入体内，外源基因表达后呈递给免疫系统，分别诱导产生细胞免疫和体液免疫应答。在过去的十多年里，DNA疫苗研究已经从实验室发展到初步的临床试验阶段，成为防治传染病、肿瘤的研究热点。    目前研究的HPV DNA疫苗既有包含早期基因的治疗性疫苗，也有包含晚期基因的预防性疫苗。HPV16L1DNA疫苗能有效刺激阴道CD8 + T细胞，这对消除病毒感染的细胞十分重要。当生殖道粘膜基底层鳞状上皮细胞暴露于病毒时，就会感染HPV。有效预防HPV感染的疫苗应该在病毒入侵的局部提供免疫保护作用。分泌型IgA能够与病毒结合，阻止其附着上皮细胞，因此，具有病毒中和活性的SIgA在预防局部感染和疾病的发生中起着重要的作用，是预防病毒侵入的第一道防线。在人和猴子的生殖道粘膜组织中检测细胞免疫和抗体分泌细胞证实，恰当的免疫途径能够在生殖道诱发产生抗体和CTL反应。HPV16L1DNA疫苗鼻腔免疫BALB/c后，产后细胞免疫和阴道粘膜局部免疫，但只能诱发弱的体液免疫反应。因此，鼻内免疫不能作为一个有效的途径，可以与HPV16L1VLP结合使用，增强VLP的免疫能力 ［14］  。其他的一些实验证实粘膜免疫不仅发生在疫苗注射部位，还可发生在远端粘膜部位 ［15］  。    HPV16E7DNA疫苗免疫小鼠，诱导产生较强的E7特异性CTL反应，保护小鼠免受肿瘤细胞的攻击。使用突变的E7DNA疫苗免疫产生的保护作用优于野生型DNA疫苗免疫效果。由于E7蛋白的转化活性，采用不同方法将其突 变来消除转化活性，增加疫苗的安全性 ［16］  。使用改造过的DNA免疫C57BL/6小鼠，不仅诱导产生E7特异性CTL，还能保护小鼠免受E7阳性肿瘤细胞的攻击。    DNA疫苗的安全性，特别是免疫后质粒的组织分布和整合是限制其应用的主要问题。不同实验室对此类问题进行了多方面的研究 ［17，18］  ，没有发现外源DNA与基因组整合的证据，同时还证明DNA疫苗接种后不会诱导产生自身DNA抗体，引起免疫系统功能紊乱。    尽管DNA免疫作为一种新的免疫方法，有许多问题需要解决。但是经过短短几年的实验室研究，其发展的强劲趋势和DNA疫苗迅速进入临床试验阶段，显示具有广阔的应用前景，它将成为预防、治疗一些重大疾病的有效手段。2.3 DNA重组活疫苗 使用细菌载体或病毒载体将目的基因导入机体，能使感染细胞内源性表达目的的基因，进行正确的翻译后修饰，刺激产生CTL反应。目前研究的表达载体有痘病毒、腺病毒、分枝杆菌（BCG）、沙门氏杆菌等。痘病毒载体容量大，感染效率高。研究证实表达E6/E7的重组痘病毒可使宿主产生CTL反应，有较好的抗肿瘤效果 ［19］  。但重组痘病毒也存在一些问题，如引起免疫缺陷患者的种痘后脑炎或进行性牛痘的发生;第二次接种后由于体内存在针对载体的抗体而降低疫苗的应答。腺病毒只与人类的良性疾病有关，作为载体毒性相对较小。重组腺病毒主要通过呼吸道诱发系统或粘膜免疫反应，通过鼻腔免疫能够在包括阴道粘膜在内的远端粘膜部位诱导产生抗体，这一特点对于预防性传播疾病非常重要。Dariusz等 ［20］  研究了HPV16L1DNA疫苗和重组腺病毒疫苗的联合应用。DNA疫苗初免后，用E1缺失的重组腺病毒鼻内加强免疫，发现其阴道洗液抗体水平较高。    在细菌中表达重组蛋白抗原是研制活疫苗的另一条途径。将编码目的基因的质粒转入病毒的细菌如分枝杆菌（BCG）、沙门氏杆菌等，作为载体将抗原呈给免疫系统。沙门氏杆菌的优点在于它的自然感染途径，可以通过口服方式进行免疫。Londono等 ［21］  将E7表位嵌入乙肝病毒核心抗原颗粒构成重组沙门氏菌疫苗，口服免疫小鼠，诱导产生特异性粘膜和系统免疫。分枝杆菌（BCG）对外源基因容量大，本身具有免疫增强效果，能激发体液和细胞免疫。研究发现表达HPV16b L1和HPV16E7的重组BCG免疫后诱导产生T细胞增生和特异性抗体，但反应强度较低 ［22］  。重组载体在宿主体内持续低水平表达目的蛋白，有利于保持免疫系统对抗原的记忆，可与其它免疫方式补充使用。    2.4 其它疫苗 其它进行研究的HPV疫苗还包括多肽疫苗，树突状细胞疫苗等。在晚期宫颈癌病人中使用HPV16E7进行Ⅰ-Ⅱ期临床试验，结果表明使用多肽疫苗免疫是可行的，为该类疫苗在健康人群应用奠定了基础 ［23］  。    3 展望　　以上简要讨论了HPV疫苗的发展现状。虽然HPV型别较多，但它极少发生变异，其型、亚型甚至主要变异株都是固定的，而且只有一小部分与癌症相关。它的变异率远远低于HIV。随着对HPV免疫作用机制的深入研究和一些疫苗临床试验的开展，研制开发有效的疫苗为一些高危类型感染者提供持久的保护，前景将是十分光明的。　　参考文献    1 Cain JM，Howett MK.Preventing cervical cancer.Science，2000，288:1753-1754.    2 Munoz N.Human papillomavirus and cancer:the epidemiological eviˉdence.Journal of Clinical Virology，2000，19:1-5.    3 李忠明.当代新疫苗，北京:高等教育出版社，2001，66.    4 S.H.Vander，Burg.Preclinical safety and efficiency of TA-CIN，a reˉcombinant HPV16L2E6E7fusion protein vaccine，in homlolgous and heterlolgous primeboost regimens.Vaccine，2001，19:3652-3600.    5 Kirnbaner R，booy F，Cheng N，et al.Papillomavirus L1major capsid protein self-assembles into VLP that are highly immunogenic.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:12180-12184.    6 Sasagawa T，Pushko P，Steers G，et al.Synthesis and assembly of virus-like particles of human papillomaviruses type6and type16in fission yeast Schizosaccharomyces pombe.Virology，1995，206:126-135.    7 Kirnbaner R，Booy F，Cheng N，et al.Papillomavirus L1major capsid protein self-assembles into VLP that are highly immunogenic.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:12180-12184.    8 Muller M，gissman L，Cristiano RJ，et al.Papillomavirrus capsid binding and uptake by cells from different tissues and species.J Virol，1995，69:948-954.    9 Harro CD，Pang YS，Roden RBS，et al.Safety and immunogenicity trial in adult volunteers of a human papillomavirus16L1virus-like particle vaccine.Journal of the National Cancer Institue，2001，93:284-292.　　10 Lehtinen M，Dillner J.Preventivehuman papillomavirus vaccination.Sex Tansm Inf，2002，78:4-6.    11 Koutsky LA，Ault KA，Wheeler CM，et al.A controlled trial of a human papillomavirus type16vaccine.The New Englang Journal of Medicine，2002，347:1645-1651.    12 Mu7ller M，Zhou J，Reed TD，et al.Chimeric papillomavirus-like partickes.Virology，1997，234:93-111.    13 Roden RC，Hubbert NL，Kirnbauer R，et al.Assessment of the serologiˉcal relatedness of genital human papillomaviruses by hemagglutination inhibition.J Virol，1996，70:3298-3301.    14 DUpuy C，Buzoni-Gatel D，Touze A，et al.Nasal immunization of mice with HPV-16VLP or with the HPV-16L1gene elicits specific cytotocxic T lymphocytes in vaginal draining lymph nodes.J Virol，1999，73:9063-9071.    15 Gallichan W.S，rosethal K.L.Specific secretory immune responses in the female genital tract following intranasal immunization with a recomˉbinant adenovirus expressing blycoprotein B of HSV.Vaccine，1995，13:1589-1595.    16 Shi W，Bu P，Liu JZ，et al.HPV16E7NDA vaccine:mutation in the openreading frame of E7enhances specific cytotoxic T lymphocyte inˉduction and antitumor activity.J of Virology，1999，73:7877-7881.　　17 Suezanne E，Parker.Pasmid DNA malaria vaccine:tissue distribution and safety studies in mice and rabbits.Human Gene Therapy，1999，10:741-758.    18 Hanke T，McMichael A.J，Samuel Rv，et al.Lack of toxicity and perˉsistence in the mouse associated with administration f candidate DNA and modified vaccinia virus Ankara（MVA）-based HIV vaccines for Kenya.Vaccine，2002，21:108-114.　    19 Gao L，Chain B，Sinclair C，et al.Immune response to human papilloˉmavirus type16E6gene in a live vaccinia vector.Journal of General Virology，1994，75:157-164.    20 Dariusz W，Kowalczyk.Vaccine regimen for prevention of sexually transmitted infections with HPV16.Vaccine，2001，19:3583-3590.　　21 Londono LP，Chatfield S，Tindle RW，et al.Immunization of mice using Salmonella typhimurium expressing HPV16E7epitopes inserted into hepatitis B virus core antigen.Vaccine，1996，14:545-552.    22 Jabbar IA，Fernando GJP，Saunders N，et al.Immune responses induced by BCG recombinant for HPV L1and E7proteins.Vaccine，2000，18:2444-2453.    23 Driel WJ，RessingME，Kenter GG，et al.Vaccination with HPV16pepˉtides of patients with advanced cervical carcinoma:clinical evaluation of b phaseⅠ-Ⅱtrial.Eur J Cancer，1999，35:946-952.     　　作者单位:100050北京天坛西门中国药品生物制品检定所           中华医学实践杂志 2004年10月 第3卷 第10期